①直接输入基因序列
②输入该基因对应转录本的序列登录号
③直接上传导入文件
④还可以设置上下游引物在导入的基因序列中的位置
5.引物参数的设置
①特异性验证
可直接输入上下游引物的序列，直接对选择需检测的数据库进行匹配；
②参数调整
“PCR product size”可以设置PCR产物的大小，“of primers to return”可以修改设计引物的数量，目前设置的参数，经过数据库匹配后，会筛选出10对PCR产物大小在70~1000bp之间的引物；
“Primer melting temperatures（Tm）”可以设置引物的Tm值范围，以及上下游引物Tm值相差的最大范围。
6.外显子/内含子跨越设置
荧光定量PCR中，为了消除基因组DNA对实验的影响，引物设计时一般会选择跨内含子；值得注意的是，如果对引物是否跨内含子有要求，必须选择序列登录号的方式导入基因序列，程序才能自动识别外显子的拼接位点。
“No preference”代表无要求，“Primer must span an exon-exon junction”代表引物必须跨越跨内含子，“Primer may not span an exon-exon junction”代表引物不能跨越跨内含子；
7.检测数据库选择
“Database”可以选择引物特异性检测的数据库。一般选择“nt”和“Refseq RNA”数据库，可以检测到引物可能扩增到的非特异性片段。
①Refseq mRNA：包含了NCBI Refseq 数据库中编码蛋白质的mRNA。适用于序列类型为mRNA的情况；
②Refseq representative genomes：以最小冗余度建立，包含了从NCBI Refseq基因组数据库中选择的参考和代表性基因组。可以判断序列的基因结构、基因组位置等，适用于序列类型为基因组DNA的情况；
③Genomes for selected organisms (primary reference assembly only)：包含了来自主要染色体装配的完整或接近完整的基因组序列，仅包括一些限定的物种。适用于不考虑替代基因组或者线粒体序列的情况；
④core_nt：基本与nt相同，只是它没有NCBI基因组组装的一部分的真核生物染色体序列；
⑤nt：包含了除EST，STS，GSS，WGS，TSA，patent，HTGS以及长度超过100 Mb序列以外的包含在GenBank，EMBL，DDBJ，PDB，RefSeq中的所有序列。适用于序列的物种、来源和类型未知的情况；
⑥Refseq RNA(refseq_rna)：包含了NCBI Refseq 数据库中编码蛋白质的mRNA和非编码RNA，包括NCBI Refseq 数据库中的NM_，NR_，XM_，XR_序列。适用于序列类型为mRNA、lncRNA等的情况；
⑦Custom：使用自己的序列，包括核苷酸序列、基因组组装加入（如GCF_000001635.27）或FASTA序列作为搜索数据库。最多允许加入20个组件，且FASTA序列被限制在300M以内。
“Organism”是指样本所属的物种，选择或输入对应的物种名称，也可以直接输入物种ID。
“Allow splice variants”一栏中，勾选“Allow primer to amplify mRNA splice variants ”代表允许引物扩增mRNA剪接变体，使得引物可以结合基因的多个转录变体。（此项需根据实验目的和要求进行选择）
8.数据库匹配
单击“Get Primers”运行
如需用以上设置的参数进行多个序列的引物设计，可勾选“show results in a new window”，引物运行的页面会在新窗口中建立；返回搜狐，查看更多